微生物群體分離純化技術(shù)

[db:作者] / 2022-11-28 00:00

從混雜的微生物群體中獲得單一菌株的方法稱為分離純化。分離純化可采用瓊脂平板劃線分離法、傾注平板法、平板表面涂布法等。需要注意的是，一次分離純化操作得到的單菌落并不一定保證是單一菌株，因此，單一菌株的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡觀察個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物要經(jīng)過(guò)多次分離純化過(guò)程才能得到單一菌株。

(一)瓊脂平板劃線分離法

平板劃線有多種方法，其目的都是要將細(xì)菌分開(kāi)，培養(yǎng)后可觀察單個(gè)菌落的特征，有斜線法、曲線法、方格法、放射法和四格法，如圖4-2所示。現(xiàn)主要介紹常用的分區(qū)斜線劃線法：燒灼接種環(huán)，待冷，取一接種環(huán)菌液。左手斜持平皿，靠近火焰周圍，右手握持沾菌的接種環(huán)伸入皿內(nèi)平行劃線，劃線范圍占平板的1/3～1/5；完成第一區(qū)域的劃線后，旋轉(zhuǎn)平板，在平板另1/3～1/5面積內(nèi)作連續(xù)平行劃線，如果菌液中菌體數(shù)量很多，劃完第一區(qū)域后需要灼燒接種環(huán)；如此重復(fù)3～4次，以達(dá)到培養(yǎng)后能獲得單個(gè)菌落的目的。

圖4-2 平板劃線法

a.斜線法b.曲線法c.方格法d.放射法e.四格法

(二)傾注平板法

本法常用于菌落總數(shù)測(cè)定、細(xì)菌對(duì)藥物的敏感度試驗(yàn)以及藥物的含量測(cè)定等。傾注平板的常用操作方法有以下兩種：

1.菌液混入培養(yǎng)基法 用無(wú)菌吸管吸取定量菌液，加入已熔化并冷卻至約50℃的瓊脂培養(yǎng)基中，迅速混勻，倒入無(wú)菌平皿，使其均勻布滿皿底。平置勿動(dòng)，凝固后即成含菌平板。此法細(xì)菌分布均勻，藥物的抑菌試驗(yàn)(藥敏試驗(yàn))多用此法制備含菌平板。

2.菌液先加入平皿法 以無(wú)菌吸管吸取定量菌液或其他含菌樣品，加入無(wú)菌平皿中，再將熔化并冷卻至約50℃的無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基傾入該平皿中，立即將平皿輕輕地旋轉(zhuǎn)晃動(dòng)，以使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，平置待凝固。計(jì)算藥品、食品等樣品中菌落總數(shù)時(shí)常用此法。由于是將定量樣品直接加入平皿中，所以菌落數(shù)較準(zhǔn)確。

(三)平板表面涂布法

由于將含菌材料加到還比較燙的培養(yǎng)基中再倒平板容易造成某些熱敏感菌的死亡，而且傾注平板法也會(huì)導(dǎo)致一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響生長(zhǎng)，這種情況下就需要采用平板表面涂布法。其做法是將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面上，再用無(wú)菌涂布棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。

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