β-受體激動劑殘留測定方法（一）

時(shí)間：2023-03-25 08:20:13來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

β-受體激動劑殘留測定方法（一）

[db:作者] / 2022-12-08 00:00

1.1.4.2測定方法

目前國內(nèi)外用于檢測動物源產(chǎn)品中β-受體激動劑的方法和手段逐漸增多，主要有感官識別、光譜分析、色譜分析、免疫分析和生物傳感器技術(shù)等。

(1)感官識別法

可以從動物服體的顏色和品質(zhì)上來判斷。含有β-受體激動劑(特別是克倫特羅)的肉色較深，較鮮艷，脂肪層非常薄，在腹股溝的脂肪層內(nèi)毛細(xì)血管分布較密，甚至呈充血狀態(tài)。內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官(心、肝、腎)充血腫脹，用手指觸之酥軟呈脂肪變性；間質(zhì)器官如肺、氣管切面見泡沫、氣腫等病變特征，有時(shí)有少量“汗水”滲出肉面。而健康肉呈淡紅色，肉質(zhì)彈性好，也不會有“出汗”現(xiàn)象。感官檢驗(yàn)法可用于對含有β-受體激動劑動物源產(chǎn)品的粗略判斷，主觀性較強(qiáng)，可為消費(fèi)者購買放心肉提供一定的參考。

(2)光譜分析技術(shù)(spectroscopy)

由于克倫特羅等β-受體激動劑溶于水和乙醇，可直接用水進(jìn)行提取，而且克倫特羅等既可顯芳香第一胺類的鑒別反應(yīng)，也可顯氯化物的鑒別反應(yīng)。因此，采用分光光度計(jì)檢測，可在243nm與296nm的波長處得到最大吸收峰。分光光度法在常溫下有較好的穩(wěn)定性。由于β-受體激動劑在生物樣品中含量甚微，該方法檢測限過高，達(dá)不到殘留分析要求，目前只限于藥品本身的常規(guī)分析。

(3)免疫分析技術(shù)(immunoassay)

免疫分析技術(shù)主要應(yīng)用于動物源產(chǎn)品中β-受體激動劑殘留樣品的篩選，具有靈敏度和特異性高、快速簡便，且一次能檢測大量樣品的特點(diǎn)。但在某些反應(yīng)中有交叉反應(yīng)，存在假陽性結(jié)果，以及對未知化合物不能測定，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到一定限制。

1)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA的基本原理基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的測定。目前，國內(nèi)外已研制出用于克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等β-受體激動劑殘留檢測的商品化ELISA試劑盒。該方法樣品前處理簡單，批量檢測成本低，適合對活體動物做大批量樣品的快速檢測。歐盟等國家已將此作為“篩選法”，用于宰前尿檢、血檢及屠宰場的檢疫。缺點(diǎn)是該法結(jié)果假陽性率較高，疑似陽性的樣本需要用儀器方法確證。Sawaya等采用ELISA法從羊尿和羊眼組織樣品中篩查殘留克倫特羅的陽性樣品。在尿樣中最低檢測限為0.272ng/g，在眼組織樣中最低檢測限為1.54ng/g。經(jīng)GC-MS確證，所有篩選出的“陽性”樣品均為陰性。但該方法具有很大的實(shí)用價(jià)值，縮短了大量樣品的篩查時(shí)間，并避免了假陰性的發(fā)生。Pleadin等采用ELISA作為定量篩選方法測定豬組織中萊克多巴胺濃度。給豬連續(xù)口服飼喂萊克多巴胺28天，停藥的1、3和8天后屠宰，測定腎臟、肝臟、肌肉、腦和心臟組織中萊克多巴胺的殘留量。該方法的平均回收率在70%～90%之間，RSD小于13%。

2)膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)

GICA的基本原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)管作用，使抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，然后用膠體金標(biāo)記的抗體來進(jìn)行直接顯色。由于膠體金肉眼可見，故陰性反應(yīng)者在膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，陽性反應(yīng)則不會形成紅色斑點(diǎn)。張敏娟等1分別用GICA法和ELISA法對豬尿樣品進(jìn)行檢測，兩種方法陽性吻合率為85.71%，當(dāng)生豬尿樣中克倫特羅的濃度大于2700ppt時(shí)，吻合率達(dá)91.67%。該法儀器設(shè)備簡單，試劑安全，對操作者沒有太高的專業(yè)技術(shù)要求，能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測；缺點(diǎn)是反應(yīng)線顏色受反應(yīng)時(shí)間影響較大。

3)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA法是利用同位素標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原同抗體發(fā)生競爭性抑制反應(yīng)的放射性同位素體外微量分析方法。目前國外已有運(yùn)用RIA測定克倫特羅的試劑盒產(chǎn)品。該法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、準(zhǔn)確快速、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，但是由于所用儀器較昂貴，對條件要求較苛刻，并且放射性同位素對操作人員有一定的傷害，從而限制了廣泛應(yīng)用。Horne等采用RIA技術(shù)測定牛肝中克倫特羅的殘留量，結(jié)合MSPD提取凈化技術(shù)，使傳統(tǒng)操作過程得到簡化。該方法回收率在86%～96%之間。

4)熒光免疫分析法(fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA)

FIA是利用三價(jià)稀土離子及其熬合物等熒光物質(zhì)作為示蹤物，代替同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗原、抗體、核酸探針等物質(zhì)的一種免疫分析方法。當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生后，根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對熒光強(qiáng)度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達(dá)到定量分析的目的。時(shí)瑾等采用時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)(TRFIA)，建立了豬尿中克倫特羅的間接競爭免疫分析方法。以克倫特羅-BSA為免疫原，制備抗體；克倫特羅與卵清蛋白(OVA)的聯(lián)結(jié)物包被96孔板為固相抗原，與游離克倫特羅共同競爭有限的抗體，用稀土離子Eu3+標(biāo)記的羊抗兔抗體進(jìn)行示蹤。該方法的靈敏度為0.01μg/L，測量范圍為0.01～25μg/L，平均回收率為99.7%，RSD為3.9%；與鹽酸異丙腎上腺素的交叉反應(yīng)率為0.01%，與沙丁胺醇、鹽酸腎上腺素、重酒石酸去甲腎上腺素?zé)o交又反應(yīng)。8條不同時(shí)間進(jìn)行的克倫特羅-TRFIA的效應(yīng)點(diǎn)值ED80、ED50、ED20分別為(0.07±0.01)ug/L、(1.47±0.11)ug/L和(23.6±0.56)ugL。尿樣經(jīng)TRFIA和ELISA試劑盒同時(shí)檢測克倫特羅，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.932，結(jié)果相符。該法具有靈敏度高、操作簡便、示蹤物穩(wěn)定、定量分析量程寬、無放射性污染和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷、療效觀察等醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用較多，但由于對溫度的強(qiáng)烈依賴性和熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)波長，因此在藥物殘留分析方面應(yīng)用較少。

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